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荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)

时间:2018-06-29     作者:北京华创恒达科技有限公司【原创】   阅读

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子生物学和细胞遗传学结合的新技术,是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。


技术原理

荧光原位杂交技术技术原理是将荧光素直接或间接标记的核酸探针[或生物素、地高辛、dinit rophenyl(I)NP)、aminoacetylAAFfluorine(AAF)等标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交,经洗涤后直接在荧光显微镜下观察。

荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术,原理是利用报告分子(如生物素、地高辛等)标记核酸探针,然后将探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交,若两者同源互补,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待DNA进行定性、定量或相对定位分析。 [1] 


技术优点

与其他原位杂交技术相比,荧光原位杂交具有很多优点,主要体现在:

①FISH不需要放射性同位素标记,更经济安全。

②FISH的实验周期短,探针稳定性高,特异性好,定位准确,能迅速得到结果。

③FISH通过多次免疫化学反应,使杂交信号增强,灵敏度提高,其灵敏度与放射性探针相当。

④多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列。

⑤既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化。也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。


技术应用

作为一种可视化特定DNA序列的分子细胞遗传学技术,荧光原位杂交技术目前被广泛应用于染色体畸变。如非整倍体、染色体重组。其基本流程包括探针标记、探针的变性、样本变性、杂交和荧光信号采集。

荧光原位杂交技术在基因定性、定量,整合、表达等方面的研究中颇具优势,目前已经被广泛应用于遗传病诊断、病毒感染分析、产前诊断、肿瘤遗传学和基因组研究等许多领域,在临床检验、教学和研究等方面扮演着重要的角色。

(一)基因(或DNA片段)染色体定位和基因图谱绘制

目前应用的基因定位的主要方法是FISH。分离到的DNA序列直接通过FISH,同时采用多种颜色荧光素的标记探针,结合中期染色体和间期细胞方面的信息,可快速确定一-系列DNA序列之间的相互次序和距离,完成基因制图。用不同颜色炎光索标记2个不同的DNA链,而且他们在染色体上的距离大于1Mbp时,可以依据不同探针信号的排列关系分辨他们在染色体上的顺序。

若采用5-溴脱氧尿嘧啶( 5-Burd )处理细胞,能够获得高分辨显带的染色体,提高DNA链标记到染色体上的分班能力。如使用间期细胞,2个DNA链的距离可以缩短至50kb,这个间距是染色体上分辨距离的1/20,不同探针的次序可以通过测量间期细胞的距离来确定。确定DNA链在染色体上的精细位置适用于检在某些特殊的染色休易位和缺失。标记同一-DNA链与不同种属细胞的染色体杂交,可以找出不同种属之间的同源基因以及基因在染色体上的位置,从而了解种属之间的进化关系。

(二)染色体数目与结构异常

在细胞遗传学检在中,重复序列的探针应用最多,包括a卫星DNA探针、β卫星DNA探针和经典卫星DNA (elassic- stllite DNA )探针。a卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒。β卫星DNA探针位于顶端着丝粒染色体及染色体的异染色质周围。经典卫星DNA探针有AATCG短片段重复,位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围。后2种探针除可用于染色体数目检查外,还可用于上述部位精细改变的检查。应用FISH技术检测染色体数目与结构异常,具有较高的特异性及敏感性,目前已被广泛应用于快速产前诊断。

(三)血液肿瘤学

临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在:染色体异位形成的融合基因的检测,如ber/abl 易位DNA探针、t( 15; 17)易位DNA探针和t( 18; 21 )易位DNA探针等;基因缺失检测可以发现一些关键基因的缺失,有助于疾病的诊断及预后判断;使用荧光原位杂交技术可对微小残留病灶进行检测,以及进行造血干细胞移植状态的监测。

(四)实体肿瘤学

在FISH技术之前的所有测定基因扩增的方法,都是采用经典的分子生物学方法,与FISH相比,这些方法不仅费时费力,而且也不能在细胞水平上观察到基因扩增的状态。FISH技术更大的优点是可以在间期细胞核上观察到DNA扩增的直接证据,而且间期细胞核所显示出的扩增DNA荧光信号的数量多少及荧光强度常与DNA扩增的水平有关。

FISH被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌,宫颈癌,肺癌和淋巴癌等实体肿瘤的辅助诊断。乳腺癌细胞中Her-2/neu基因的扩增常预示着患者预后较差,25% ~ 30%的乳腺癌患者有Her-2/neu基因的扩增和/或过度表达。应用Her -2/neu基因DNA探针检测Her-2/neu基因的扩增表达水平,有利于对乳腺癌进行临床诊断及疗效监测。使用染色体着丝粒特异性探针可以对间期细胞进行染色体数量变异分析,如Hopman采用FISH技术研究膀胱癌,发现9号染色体的丢失。采用多种染色体探针,以不同的颜色标记,可用于肿瘤染色体数目改变的异质性研究。目前,FISH主要集中用于对肿瘤的早期诊断、疗效检测,个体化治疗和预后判断等方面。 


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